BJS 201707 植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定
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BJS 201707 植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定

BJS 201707 植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定


食品产业网 (2017年6月22日15:36)
  1 范围

  本方法规定了食品核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分鉴定的实时荧光PCR方法。

  本方法适用于核桃露(乳)、杏仁露、果仁露等复合植物蛋白饮料中标识含有核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分的检测及鉴定。

  2 原理

  提取试样中基因组DNA,以DNA为模板,利用物种特异性引物及探针进行实时荧光PCR扩增检测,同时设置阳性、阴性及空白对照。根据扩增的Ct值,判定试样中是否含有该源性成分。

  3试剂和材料

  除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB 6682的要求。所有试剂均用无

  DNA酶污染的容器分装。

  3.1核桃源性成分Jugr2基因检测用引物对序列为:

  核桃5’端引物:5’-CGCGCAGAGAAAGCAGAG-3’

  核桃3’端引物:5’-GACTCATGTCTCGACCTAATGCT-3’

  核桃探针:5’-FAM-TTGTGCCTCTGTTGCTCCTCTTCCC-TAMRA-3’

  3.2花生源性成分Ara b2基因检测用引物(对)序列为:

  花生5’端引物:5’-GCAACAGGAGCAACAGTTCAAG-3’

  花生3’端引物:5’-CGCTGTGGTGCCCTAAGG-3’

  花生探针:5’-FAM-AGCTCAGGAACTTGCCTCAACAGTGCG-Eclipse-3’

  3.3 杏仁源性成分Prudul基因检测用引物(对)序列为:

  杏仁5’端引物:5’-TTTGGTTGAAGGAGATGCTC-3’

  杏仁3’端引物:5’-TAGTTGCTGGTGCTCTTTATG-3’

  杏仁探针:5’-FAM-TCCATCAGCAGATGCCACCAAC- Eclipse-3’

  3.4芝麻源性成分2S albumim mRNA基因检测用引物(对)序列为:

  芝麻5’端引物:5’-CCAGAGGGCTAGGGACCTTC-3’

  芝麻3’端引物:5’-CTCGGAATTGGCATTGCTG-3’

  芝麻探针:5’-FAM-TCGCAGGTGCAACATGCGACC- TAMRA-3’

  3.5榛子源性成分oleosin基因检测用引物(对)序列为:

  榛子5’端引物:5’-CCCCGCTGTTTGTGATAT-3’

  榛子3’端引物:5’-ATGATAATAAGCGATACTGTGAT-3’

  榛子探针:5’-FAM-TCCCGTTCTCGTCCCTGCGGT- Eclipse-3’

  3.6大豆源性成分Lectin基因检测用引物(对)序列为:

  大豆5’端引物:5’-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3’

  大豆3’端引物:5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3’

  大豆探针:5’-FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC- TAMRA-3’

  3.7真核生物18SrRNA内参照检测用引物(对)序列为:

  内参照5’端引物: 5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’

  内参照3’端引物: 5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’

  内参照探针:5’-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC- TAMRA-3’

  3.8 CTAB缓冲液:55 mmol/L CTAB,1400mmol/L NaCl,20 mmol/L EDTA,100 mmol/L Tris,

  用10%盐酸调节pH 至8.0,121℃高压灭菌20 min, 备用。

  3.9 蛋白酶K:20mg/mL。

  3.10苯酚:氯仿:异戊醇(体积比:25:24:1)。

  3.11 异丙醇。

  3.12 70%乙醇。

  3.13 Taq DNA聚合酶。

  3.14 dNTP混合液。

  3.15 TE缓冲液(Tris-HCl、EDTA缓冲液):10mmol/L Tris-HCl(pH8.0),1 mmol/L EDTA(pH8.0)。

  3.16 10×PCR缓冲液:200 mmol/L KCl,15 mmol/L MgCl2,200 mmol/L Tris-HCl(pH8.8)。

  4仪器和设备

  4.1 组织研磨器。

  4.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。

  4.3 恒温水浴锅。

  4.4 离心机:离心力12,000g。

  4.5 微量移液器(0.5μL~10μL,10μL~100μL,10μL~200μL,100μL~1000μL)。

  4.6 实时荧光PCR仪。

  4.7 涡旋振荡器。

  4.8 天平:感量0.01g。

  5分析步骤

  5.1 试样总DNA的提取

  固体样品:将样品粉碎后称取0.3~0.6 g,按下列方法提取DNA。也可用等效商品化DNA提取试剂盒提取DNA。

  液体样品:取1 mL 样品于Eppordorf管中,加入1 倍体积的异丙醇,混合均匀,室温下沉淀5 min,室温下以12,500 rpm 离心5 min,弃去上清液。重复此操作一次。所得的沉淀用于提取DNA。可按下列方法提取DNA,也可用等效商品化DNA提取试剂盒提取DNA。

  (1)将处理后的样品加入2 mL离心管中,加入600 μL CTAB缓冲液和40 μL蛋白酶K溶液,振荡混匀,65℃孵育1 h(过夜孵育更好), 期间每隔10 min振荡混匀;

  (2)加入500 μL的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),振荡抽提10 min,室温下以12,500 rpm 离心10 min;

  (3)小心吸取上清液,加入等体积的异丙醇,振荡均匀,12,500 rpm 离心10 min;

  (4)弃去上清液,用65℃预热的TE缓冲液溶解DNA;

  (5)小心吸取上清,加入200 μL氯仿:异戊醇(24:1),振荡抽提,室温下以12500 rpm 离心15 min;

  (6)小心吸取上清液,加入等体积的异丙醇,振荡均匀,12,500rpm 离心10 min;

  (7)弃去上清液,沉淀用70% 乙醇洗涤,离心1min,晾干,溶于50μLTE 缓冲液中。

  5.2 DNA浓度和纯度的测定

  取1μL DNA溶液,使用核酸蛋白分析仪检测其浓度及质量,OD260/280值应在1.7~1.9之间时,适宜于PCR扩增。

  5.3 实时荧光PCR扩增

  反应体系总体积为25μL,其中10×PCR缓冲液5μL,正反向引物(10μmol/L)各1μL,探针(10μmol/L)1μL,dNTPs(10μmol/L)2μL ,Taq DNA聚合酶(2.5U)0.2 μL,DNA模板(10-100ng/μL)2μL,用灭菌去离子水补足至总体积25μL。真核生物内参照的反应体系同上,仅替换相应的引物和探针。也可使用相应的商品化扩增试剂盒。

  反应参数:50℃ 2min; 95℃ 15min; 95℃ 15s, 60℃ 1min, 40个循环。

  5.4 实验对照

  检验过程分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。以相应植物源物种提取的DNA为阳性对照,以已知不含该植物源的物种DNA为阴性对照,以灭菌水为空白对照。样品、内参照和对照设置两个平行的反应体系。

  6结果判断与表述

  6.1 质量控制

  以下条件有一条不满足时,结果视为无效:

  (a)空白对照:无FAM荧光信号检出;

  (b)阴性对照:无FAM荧光信号检出;

  (c)阳性对照:有FAM荧光信号检出,且FAM通道出现典型的扩增曲线,Ct值≤35.0;

  (d)内参对照:有荧光对数增长,且荧光通道出现典型的扩增曲线,相应的Ct值<30.0。

  6.2 结果判定

  (a)如Ct值≤35.0,则判定为被检样品阳性;

  (b)如Ct值≥40.0,则判定为被检样品阴性;

  (c)如35.0<Ct值<40.0,则重复试验一次。如再次扩增后Ct值仍为35.0<Ct值<40.0,则判定被检样品可疑。

  6.3 结果表述

  结果为阳性者,结合产品标识,表述为“检出XX源性成分”。

  结果为阴性者,结合产品标识,表述为“未检出XX源性成分”。

  结果为可疑者,结合产品标识,表述为“XX源性成分可疑”。

  7防污染措施

  检测过程中放置交叉污染的措施按照GB/T 27403中的规定执行。

  本方法负责起草单位:河北省食品检验研究院。

  验证单位:中国食品药品检验研究院、北京市食品安全监控和风险评估中心、湖北省食品质量安全监督检验研究院、武汉食品化妆品检验所、河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中国肉类食品综合研究中心。

  主要起草人:周巍、王爽、章晶晶、崔生辉、李永波、孙勇。

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